新品推荐：ELAREM™ Perform-FD PLUS I 科研间充质间质细胞(MSCs)体外扩增的培养基一般添加胎牛血清FBS，但是考虑到异种感染及免疫反应的风险，监管机构并不鼓励使用。人血小板裂解物(hPL)除了不存在异种免疫反应或牛病原体感染的风险，有助于增强间充质干细胞的扩增，也相对容易地根据良好的生产规范程序生产，并已用于临床应用，现如很多资料显示hPL已被证明是扩增MSCs一种非常有效的FBS替代方法。 hPL由血浆组成，含有纤维蛋白原和凝血因子，对于一般细胞培养中涉及的含钙培养基来说通常需要加入抗凝剂（常用肝素、Rivaroxaban利伐沙班、argatroban阿加曲班等）来防止凝胶形成，其中肝素*为常用。 那么经常有客户会问道肝素的使用浓度到底如何抉择呢？添加培养之前有必要花时间来优化下这个浓度参数吗？ 通过比较不同浓度的普通肝素（unfractionatedheparinUFH，分子量3000-30000Da)和低分子肝素(LMWH-分子量2000-12000Da)在hPL培养基中培养MSCs的增殖能力、成纤维细胞体外集落形成单位（colony-formingunit，CFU-F）、免疫表型和体外分化等情况如下。 hPL中肝素浓度对于MSCs扩增的影响 1）肝素浓度与间充质干细胞增殖的影响 MSCs在添加10%hPL和不同浓度肝素的培养基中培养7天，随后使用MTT法评估增殖。 普通肝素和低分子肝素浓度对于MSCs细胞增殖的影响 脂肪组织源性间充质干细胞（AT-MSC）和骨髓源性间充质干细胞（BM-MSC）培养的过程中，如果使用的UFH浓度低于0.61IU/mL或者使用Enoxaparin（LMWH）浓度低于0.024mg/mL(2.4IU/mL)时培养液均呈现凝胶状态（灰色背景），而肝素浓度过高则对细胞增殖的负面影响显著且以剂量依赖的方式提高。备注肝素浓度单位换算：肝素浓度国际单位(IU)衡量，1IU国际单位是指在规定的条件下，将1ml全血延长凝血3分钟所需的量：1mg大约相当于100IU的肝素。 为了排除hPL对于细胞增长的抑制作用可能与防腐剂（这里采用苄醇作为防腐剂添加到UFH或LMWH中）有关。下图左右两图是我们对不添加防腐剂的肝素进行了相同实验，结果对AT-MSC和BM-MSC细胞增殖抑制趋势相同。 无防腐剂肝素浓度对于MSCs细胞增殖的影响 图中显示在随后的传代培养到3代中的累积的群体中，两种肝素UFH和LMWH对MSC增殖的影响也变得明显，肝素浓度较累较低时，积细胞群体倍增指数(cPD)较高。 肝素浓度对于累积细胞群体倍增指数cPD的影响 2）肝素浓度对CFU-F细胞集落形成单位率的影响 肝素浓度对于CFU-F的影响 CFU-F的塑料粘附生长性能是MSCs培养的先决条件，在96孔板中通过有限稀释的方法结合泊松统计进行CFU-F试验，如图5中显示集落形成率CFU-F在高浓度UFH时中度降低，而在高浓度Enoxaparin（LMWH）时显著降低。这些结果表明高浓度的LMWH减少了CFU-F的形成，这与已报道的其他研究结论一致。 3）肝素浓度细胞形态或免疫表型影响 MSCs是异质性的细胞群，其组成可能受培养条件的影响。肝素及其浓度高低对细胞形态和生长模式并未有明显的影响。 光显微镜下观察 图中通过免疫荧光显微镜分析未发现波形蛋白(一种通常在中胚层起源的细胞中表达的中间丝)和α-SMA表达的差异，肝素浓度对于α-SMA(绿色)和波形蛋白(红色)的分布并无影响。 流式细胞术对于MSCs的表型分析 脂肪组织源性间充质干细胞（AT-MSC）和骨髓源性间充质干细胞（BM-MSC）本身免疫表型就是相似的，经添加不同浓度肝素的hPL培养扩增的AT-MSC和BM-MSC的流式细胞分析结果显示出CD29、CD73、CD90和CD105表达，而表面标记CD14、CD31、CD34和CD45的缺失，可见肝素浓度对MSC免疫表型的表达水平几乎是没有影响的。 4）肝素浓度对成脂和成骨分化能力的影响
肝素浓度对成脂和成骨分化能力的影响 通过BODIPY染色的脂肪滴来反映的成脂分化情况，发现两种肝素UFH和LMWH在高浓度时，分化成脂细胞的百分比显著降低。同样的，右图中通过茜素红染色的磷酸钙沉淀分析成骨分化情况，高浓度肝素也降低了成骨分化的百分比，特别是在脂肪组织来源的MSCs中，UFH肝素高浓度对成脂和成骨分化诱导的负面影响*为显著。 基于上述结果，我们现在知道hPL中添加的抗凝剂肝素在体外MSCs扩增的必要性，在购买hPL后，用户应结合自己的实验条件去合理的选择*适肝素浓度，而肝素浓度的选择应该在有效防止含hPL培养基凝胶形成的基础上尽量降低，以减少肝素对于MSCs的增殖能力、成纤维细胞体外集落形成单位（CFU-F）、MSCs体外分化等的影响。 MSCs扩增的hPL解决方案 现在咱们已经了解到肝素对于hPL使用浓度优化的必要性。推荐一款德国PLBioscience公司的ELAREM系列的高性价比人源血小板裂解物，采用纤维蛋白去除技术，不用添加抗凝剂即可到达较好的培养效果。 1.什么是纤维蛋白原，为什么它通常存在于人体血小板裂解液中？纤维蛋白原是人体内血液凝固的主要底物。它是继白蛋白之后血液循环中*常见的蛋白质。当出现伤口时，它的功能就开始发挥作用。然后，凝血级联被激活，出现 "凝血酶爆发"。这导致形成稳定的纤维蛋白凝块。纤维蛋白与血小板和另一种凝血因子（XIIIa）一起形成稳定的纤维网，以尽快闭合伤口。我们的产品由人类血小板制成。这些原始血小板含有凝血因子，包括纤维蛋白原，可在出血时形成血凝块。我们将人血小板裂解物分为含纤维蛋白原和不含纤维蛋白原两种。 2.使用去纤维蛋白原人血小板裂解物的益处 去纤维蛋白原人血小板裂解液简化了从含血清细胞培养基的过渡。细胞培养方案只需调整所使用的 HPL 浓度（针对细胞类型），而不需要执行。 3.去纤维蛋白原 HPL 的特性 尽管我们的研究表明纤维蛋白含量和纤维蛋白原缺乏对细胞培养性能都没有影响，但一些研究表明，由于肝素可能具有促炎特性，因此消耗纤维蛋白原和避免使用肝素可能是有益的。 4.如何去除纤维蛋白原？要从未加工的人类血小板浓缩物中去除纤维蛋白原，需要经过各种水凝胶形成、破坏和离心步骤。目前的纤维蛋白原去除技术包括添加（不含异种）抗凝剂。这一步骤可防止 HPL 中残留的低水平纤维蛋白原凝结。"迄今为止，减少纤维蛋白原和避免使用[抗凝剂]的程序都是基于在未稀释的 pHPL 中加入 CaCl2 来拮抗柠檬酸盐效应和诱导凝血级联，从而产生血清转化的血小板裂解液。 5.纤维蛋白原耗竭会对性能产生影响吗？ 纤维蛋白原去除过程不会影响产品在细胞生长和分化潜力方面的性能。 去纤维蛋白原的人血小板裂解液？一起来看看 6.为什么避免使用抗凝剂有益？研究表明，抗凝剂会影响细胞的增殖、集落形成和体内外分化能力。 这种影响主要取决于： 抗凝剂的质量；抗凝剂的起源以及细胞培养中的用量。 由于细胞培养过程中培养基凝胶化（凝固）会阻碍细胞增殖，因此需要在非纤维蛋白原贫化的 HPL 中添加抗凝剂，以防止纤维蛋白原形成纤维蛋白。 抗凝剂种类繁多。不过，由于动物来源的抗凝剂容易获得且价格低廉，因此在研究中使用*多。也有价格稍高的合成抗凝剂。这些类型的抗凝剂的止凝浓度各不相同。在 HPL 中使用猪抗凝剂的缺点是无法使细胞培养完全人性化。 我们的新产品 ELAREM™ Perform-FD PLUS 不含任何抗凝剂。 ELAREM™ Perform-FD PLUS 来自欧盟原产血小板单位，可确保*长的原料追溯期。 我们优化了*新产品的生产工艺：无需在*终细胞培养基或生产过程中使用任何抗凝剂，即可去除纤维蛋白原。 产品简介：ELAREM™ Perform-FD PLUS 是一种无血块、去纤维蛋白原且不含抗凝剂的欧盟产人类血小板裂解物。作为一种不含动物成分且易于使用的细胞培养补充剂，ELAREM™ Perform-FD PLUS 可高效、安全地支持各种原代细胞和细胞系的体外扩增。 并且考虑到用户从科研到临床的过渡需求，我们曼博生物为各位用户提供各种研究级、GMP/临床级的hPL以支持学术研究、工业生产以及体外诊断行业中的细胞扩增应用。
|
